Sanger 双脱氧链终止法

双脱氧链终止法（英语：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又称桑格法（英语：Sanger method），为一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法。

原理

双脱氧链终止法采用DNA复制原理，常见的DNA复制体系使用单脱氧核糖核苷酸，其核苷酸的3’能与其他核苷酸的5’结合形成磷酸二酯键，即手拉手形成DNA骨架。

经过改造后的的ddNTP，其3’的羟基被脱去，失去与5’脱水缩合能力，从而在此形成断链，中止DNA链的延伸。此外这些ddNTP上还连接有放射性同位素或者荧光基团，能被仪器捕获到。

以下是一些最常用的带有荧光基团的ddNTP：

测序过程

体系

• 单链DNA模版

  Sanger测序法的经典测序反应是将靶DNA片段克隆于 M13mp载体，从重组克隆噬菌体颗粒中分离得到单链DNA模板，再按Sanger 法进行测序。

• DNS引物（Primer

  和PCR的作用类似，与DNA模版的部分序列互补配对，确定起始位置，一般来说，通用引物的 长度以15~30bp 为宜。

• DNA聚合酶

  用来合成DNA长链

• 正常的脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）

• 改造后的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）

• 缓冲液

测序反应

之后在反应体系内进行复制，在此过程中存在着两种复制情况：

• dNTP

  如果DNA聚合酶刚好连接的是dNTP，则反应可以继续下去，DNA就可以正常连接形成长链，和正常PCR复制相同

• ddNTP

  如果DNA聚合酶连接的是ddNTP，此时由于其3’缺少羟基，无法发生正常的聚合反应，因此复制中断，形成短连接

实际上复制的过程要分为四次，分别往四个独立的体系中加入ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，分别进行四次测序反应，分别显影（关于这个部分实际上存在疑问，有些资料说可以同时测序，有些则提出需要分别测序

具体的复制情况如下图所示：

分离

按照更合理的顺序来说，这个过程需要四个单独的反应来测试所有四种 ddNTP。在从结合引物进行多轮模板 DNA 延伸后，将所得 DNA 片段热变性，并使用凝胶电泳按大小进行分离。 1977 年的最初出版物中，ssDNA 碱基配对环的形成是在某些位置解析条带时遇到严重困难的原因。这通常使用变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶进行，四个反应中的每一个都在四个单独泳道（泳道 A、T、G、C）之一中运行。然后可以通过放射自显影或紫外光观察 DNA 带，并且可以从X 射线胶片或凝胶图像上直接读取 DNA 序列。

番外

脱氧核苷酸三磷酸和脱氧核糖核苷酸的区别：

下面是GPT给出的解释：

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脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP）和脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）是两种密切相关的分子，但它们之间有一些关键的区别：

	1.磷酸基团的数量：
	•	脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：包含一个核苷（由一个脱氧核糖和一个碱基组成）以及三个磷酸基团。这是DNA合成过程中使用的前体分子。在DNA复制或修复中，dNTP会失去两个磷酸基团，生成相应的脱氧核苷酸并加入到DNA链中。
	•	脱氧核糖核苷酸：通常指的是核苷和一个磷酸基团，即单磷酸脱氧核糖核苷酸（如dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）。它是dNTP在被加入到DNA链中后留下的形式。
	2.功能：
	•	dNTP：作为DNA聚合酶在合成DNA链时的原料。在合成过程中，dNTP提供碱基，并通过形成磷酸二酯键将其插入到新生的DNA链中。
	•	脱氧核糖核苷酸：这是DNA链中的构成单元，每一个碱基在DNA链中都是以单磷酸形式存在。
	3.化学结构：
	•	dNTP：核糖上的2’位碳是氢（去除了2’位的羟基），并且连接三个磷酸基团（α、β、γ磷酸）。
	•	脱氧核糖核苷酸：核糖上的2’位碳也是氢，但只有一个磷酸基团（α磷酸）与其相连。

总结来说，dNTP是含有三个磷酸基团的DNA前体分子，而脱氧核糖核苷酸通常是指单磷酸的形式，是dNTP在参与DNA合成后的产物。

我认为，脱氧核苷酸三磷酸在参与DNA的复制过程中，为复制过程中提供能量，发生去磷酸化，从而磷酸基团断裂，生成相应的脱氧核糖核苷酸并加入到DNA链中。

因此体系中加入脱氧核苷酸三磷酸不仅仅解决了复制原料问题，还解决了能量问题。

参考目录：Sanger sequencing、桑格测序、《高通量测序技术》